EXAMEN PARASITOLOGIQUE DES SELLES

 

1. Définition

Les selles constituent le véhicule normal des formes de dissémination des parasites dans le milieu extérieur. L'examen parasitologique des selles met en évidence et identifie tes parasites éventuellement présents à l'intérieur du tube digestif humain. Cette analyse permet le dépistage et le diagnostic étiologique des maladies parasitaires, ce qui permet au clinicien de démarrer ou de réajuster une action thérapeutique efficace/ bien adaptée au malade et à son contexte épidémiologique.

2. Prélèvement

Le clinicien doit fournir au biologiste les informations concernant l'origine géographique et la symptomatologie du malade pour orienter ses recherches. En effet chaque parasite n'est bien mis en évidence que par une technique qui lui est spécifiquement adaptée. L'examen parasitologique des selles nécessite 3 examens coprologiques à quelques jours d'intervalle après une préparation correcte du malade.

2.1 préparation du malade

On conseille au malade pendant les 3 jours qui précèdent le prélèvement de supprimer :

- les compositions pharmaceutiques contenant du charbon végétal, du bismuth, des sels de magnésium, du kaolin et du benzonaphtol.

- les produits opaques utilisés en radiologie, en particulier les composés barytes.

- les suppositoires et les huiles laxatifs, en particulier l'huile de paraffine. La présence de ces éléments dans les selles rend l'examen microscopique difficile, car ils augmentent le volume des culots de centrifugation et peuvent être la cause d'erreurs d'identification avec des parasites authentiques. Il est utile de prescrire au patient un régime alimentaire à faible résidu pendant les 3 jours qui précèdent le prélèvement.

2.2 le prélèvement de la selle

Le malade déposera sa selle, le matin, au laboratoire dans un récipient propre, sec et sur lequel est collé une étiquette portant l'identité du malade. Il faut bien indiquer au patient qu'il doit déposer la totalité de la selle dans le récipient et qu'il ne doit pas y mélanger de l'urine, du papier hygiénique ou des fragments de coton. Si le malade ne peut pas se déplacer, la selle doit parvenir au laboratoire le plus rapidement possible pour éviter une baisse de la température du prélèvement qui risque de lyser les protozoaires sous forme végétative.

Conservation de la selle :

Dans le cas contraire, on propose au patient la conservation de la selle dans une solution de MIF ( Merthiolate, Iode, Formol) qui se compose de la manière suivante :

Réactif 1

Teinture de Merthiolate      200 ml

Formol                        25 ml

Glycérine                       5 ml

Eau distillée                     250 ml

à conserver dans un flocon brun à l'abri de la lumière pendant une durée ne dépassant

pas 3 mois,

Réactif 2

Iode      0,5 g

lodure de Potassium    1 g

Eau distillée   10 ml

Dissoudre d'abord l'iodure de potassium dons l'eau, puis ajouter l'iode. À conserver dans un flocon brun à l'abri de la lumière pendant une durée ne dépassant pas 01 mois. On remet au malade deux tubes à hémolyse, bien bouchés et un agitateur:

Tube A contenant 2,35 ml du réactif 1

Tube B contenant 0,15 ml du réactif 2

On explique au malade que le prélèvement devra être effectué aussitôt après l'émission fécale, de la manière suivante :

Verser le contenu du tube A dans le tube B (et non l'inverse) et mélanger. Prélever un gros pois de selles avec une spatule et l'introduire dans le tube B et mélanger. Expédier le tout au laboratoire ( le tube B et le reste des selles dans une boite é+anche). Cette méthode assure la conservation et la coloration des éléments parasitaires. De même, elle permet un prélèvement très simple et un examen différé. Spontanément, après sédimentation de 15 à 30 mn ou après centrifugation de 2 mn à 1500 tr/mn, les formes parasitaires se rassemblent en surface du culot. On recueille à la partie supérieure du culot, une goutte de liquide avec une pipette pasteur et on l'examine entre lame et lamelle. Chez les personnes constipées, on peut proposer une réactivation douce. La veille de l'examen, le malade prend avant de se coucher une cuillère à café de sulfate de magnésie. Cette purgation favorise l'apparition des formes végétatives des protozoaires mais cette méthode a l'inconvénient d'augmenter le volume de la selle.

3. Matériel

• Matériel commun en parasitologie.

• Fbssoires à thé conique de diamètre 70 mm (type chinois) avec des mailles de 1 mm environ.

• Verre à pied de 60 ml et de 250 ml

• Bec de bunsen

• Gaz (butane}

• Ensemenceur bactériologique

• Entonnoirs de verre de diamètre 50 mm

• Agitateurs en verre à bouts rodés de diamètre 2 à 5 mm

• Tubes à centrifuger coniques de 20 ml avec bouchons

• Pissette en polyéthylène

• Pinces

4. Réactifs

• Teinture de Merthiolate

• Formol officinal

• Glycérine

• Eau distillée

• Eau physiologique stérile

• Iode

• lodure de potassium

• Chlorure de sodium

• Ether

• Acide acétique

• Acétate de sodium

• Glycérine

• Solution de vert de malachite

• Fuchsine phéniquée

• Méthanol

• Acide sulfurique

 


5. Technique de l'examen coprologique

5.1 L'examen macroscopique

II faut noter la couleur et la consistance de la selle/ ainsi que la présence éventuelle de sang, de glaires, de mucosités et de pus.  Sur des selles moulées ou pâteuses, on recherchera particulièrement les oeufs d'helminthes et les kystes de protozoaires. Pur contre, sur des selles molles, diarrhéiques ou muco-sanguinolantes, on s'attachera à rechercher avant tout les formes végétatives des protozoaires. L'examen macroscopique permet de déceler certains parasites sous forme adulte tel que : des anneaux de Ténia, des vers d'Ascaris, d'Oxyure, de Trichocéphale,d'Ankylostome ou autres dont l'identification sera confirmée par l'examen microscopique, au besoin après éclaircissement à l'acide acétique. Ce procédé est particulièrement indiqué pour 5 l'examen des cestodes dont les téguments sont riches en calcaire. Après un séjour de 2 heures j| dons t'acide acétique pur, on écrase légèrement le parasite entre 2 lames. Il devient transparent et permet l'étude de son anatomie ce qui facilite le diagnostic d'espèce.

5.2 L'examen microscopique

II recherche les oeufs et larves d'helminthes, les formes végétatives et kystiques des protozoaires. Il signale aussi la présence de leucocytes, d'hématies, d'éléments fongiques;

de cristaux et de résidus alimentaires dans la selle. L'examen microscopique comporte toujours un examen direct et deux techniques d'enrichissement.

5.2.1 l’examen direct

C'est le procédé le plus simple, le plus rapide et le moins coûteux qui permet d'observer les parasites dans les selles. Il montre aussi la mobilité des formes végétatives des protozoaires. Il comporte deux préparations, la première à l'eau physiologique et la deuxième au lugol.

5.2.1.1 Examen direct à l'eau physiologique

Prélever, à l'aide d'un agitateur/ une petite parcelle de matière fécale et l'étaler dans une goutte de sérum physiologique, sur une lame qu'on recouvrira d'une lamelle. La préparation doit être mince et examinée en entier ; tout d'abord au grossissement (obj x 10), une fois les éléments parasitaires suspects repérés on les confirme au grossissement (obj x 40).

5.2.1.2 Examen direct au lugol

II suit les mêmes modalités que précédemment sauf que la goutte d'eau physiologique est remplacée par une goutte de lugol.

• Lugol :

Iode  1 g

lodure de potassium    2 g

b) Les méthodes diphasiques ou physico-chimiques

Elles sont caractérisées par la mise en présence de deux phases liquides non miscibles, l'une aqueuse et l'autre constituée par f'éther qui est un solvant des lipides. Il se crée un coefficient de partage entre ces deux phases et la répartition de chaque élément fécal dans chacune d'elles sera fonction de son pouvoir hydrophile ou lipophile.

METHODE DE RITCHIE

Une quantité de 2g de selles est diluée dans 20 ml d'eau formolée à 10%, puis tamisée

sur un chinois. On recueille 2 ml du filtrat dans un tube à centrifuger dans lequel on ajoute

I ml d'éther. On bouche le tube et on agite de façon à obtenir une émulsion homogène. On centrifuge 2 minutes à 2000 tr/mn. On obtient trois couches, une couche aqueuse, une couche épaisse contenant des débris et une couche éthérée légèrement jaunâtre. On vide le tube brusquement. A l'aide d'une pipette pasteur, on récupère le culot de centrifugation qu'on examine entre lame et lamelle.

METHODE DE BAILENGER

On opère de la même façon que dans la technique de Ritchie en remplaçant le formol à 10% par la solution suivante ;

Acétate de sodium       15g                                          

Acide acétique           3,60 ml

Eau distillée              1000 ml                                      

II est très important d'ajuster le pH à 5 avec de l'acide acétique afin de favoriser la Jl concentration parasitaire.

c) Les techniques spéciales

METHODE DE KATO

Elle permet de mettre en évidence uniquement les oeufs d'helminthes dans une quantité relativement importante de selles. Plonger pendant 24 heures des petits rectangles de papier Cellophane de 2 cm x 3 cm dans le réactif suivant:

Glycérine      100 ml

Eau distillée     100ml

Solution de vert de malachite à 3 %  1 ml

On dépose 50 mg de selles sur une lame porte objet qu'on recouvre d'un rectangle de papier Cellophane préalablement immergée 24 heures ou plus dans la solution précédente. On retourne la préparation et on l'écrase sous plusieurs épaisseurs de papier filtre de façon à bien l'étaler. Laisser reposer 60 minutes à la température du laboratoire ou 15 minutes à 37°C. Examiner ensuite au microscope. Si on utilise une quantité précise de selles, on peut pratiquer une numération des oeufs.

METHODE DE BAERMANN ET LEE

C'est une technique de recherche des larves d'Anguillules et d'Ankylostomidés qui met à profit l'attirance manifestée par ces larves pour l'eau tiède. On pose dans une passoire à thé un petit carré de gaze et une feuille de papier kleenex pliée en deux sur laquelle on dépose 5 grammes de selles. Les coins de la gaze sont rabattus par dessus et le tout est disposé sur un entonnoir qui est relié à un tube en caoutchouc souple maintenu obturé par

une pince de Mohr. L'entonnoir est rempli à moitié d'eau tiède (37°C). Le fond de la passoire doit affleurer la surface de l'eau. Les larves quittent la selle pour aller se concentrer dans l'eau. Au bout de 2 heures ou mieux 24 heures, ouvrir la pince de Mohr et recueillir l'eau dans un tube qui sera centrifugé et dont le culot sera examiné au microscope. Les larves sont mobiles et apparaissent bien au faible grossissement.

LE SCOTCH TEST ANAL OU TEST DE GRAHAM

Appliquer autour de l'anus du patient la face adhésive d'un petit ruban de scotch le matin avant la toilette et la défécation. Coller te scotch sur une lame porte objet et examiner au microscope. Cette technique est utilisée pour la recherche des oeufs d'oxyures ; il peut arriver qu'elle montre parfois des oeufs de Taenia.

5.2.2.2 Les techniques de coloration permanentes

COLORATION A L'APV TRICHROME

Cette technique est utilisée pour la fixation et la coloration des frottis de selles. Elle permet une meilleure identification des protozoaires particulièrement les amibes. Les frottis doivent être réalisés à partir de selles fraîches pour obtenir des formes végétatives intactes.

* Solution d'APV

Préparer une solution aqueuse saturée à froid de chlorure mercurique (Hg Cl2); dissoudre à chaud 10% d’Hg Cl2 et laisser refroidir. Les cristaux tombent au fond. Décanter le surnageant clair.

- Solution de Schaudin

2 volumes de solution aqueuse d'HgC12 à saturation

1 volume d'alcool éthylique à 95%     93,5 ml

- Glycérol   1,5 ml

- Acide acétique glacial    5 ml

- Ajouter 5 g d'APV progressivement

* Colorant de Gomori

- Chromotrope 2 R    0,6 g

- Vert lumière SF    0,3

- Acide phosphotungstique      0,7 g

- Acide acétique     1 ml

- Eau distillée   100 ml

Ces deux solutions se conservent bien pendant un an.

On met dans un tube à hémolyse un volume de selles et trois volumes de solutions d'APV A partir de cette solution, on réalise un frottis qu'on met dans l'alcool iodé à 70% pendant 10 minutes, puis dans l'alcool à 70% pendant 2 minutes, puis dans l'alcool à 50% pendant 2 minutes et rincer à l'eau du robinet. On plonge le frottis dans le colorant de Gomori pendant 30 minutes puis quelques secondes dons l'alcool à 90% additionné de 0/5% d'acide acétique. Rincer à l'alcool à 95% pendant 30 secondes puis dans l'alcool absolu pendant 1 minute. Mettre dans le xylène pendant 5 minutes et monter dans une baume.

COLORATION DE ZIEHL NEELSEN MODIFIEE

Elle permet la mise en évidence des oocvstes de Crvptosporidium qui apparaissent comme des éléments arrondis ou ovoïdes de 4 à 6 microns colore en rouge vif sur un fond vert. On fait un frottis mince de selles qu'on fixe au méthanol pendant 5 minutes et on le laisse sécher à l'air.

On le colore dans une solution de fuchsine phéniquée pendant une heure. On rince à l'eau puis on agite doucement ta lame dans une solution d'acide sulfurique à 2% pendant 20 secondes. On rince à l'eau et on effectue une contre coloration dans une solution de vert de malachite à 5% pendant 5 minutes. Après avoir rincé le frottis avec de l'eau/ on le sèche à l'air et on l'examine ou microscope optique au grossissement (obJ xi 00).

6. Résultat et interprétation

Cette analyse a pour but de montrer la présence éventuelle des parasites suivants dans les selles:

Les protozoaires Les amibes, les flagellés Les ciliés, les sporozoaires Les helminthes Les cestodes (Ténias) Les trématodes: les douves, les bilharzies Les nématodes: Ascaris, Oxyure, Ankylostomidés... Les acariens

Par ailleurs, on doit retrouver dans le compte rendu du résultat des informations succinctes concernant les éléments suivants:

* Les résidus de digestion

• Les résidus d'origine animale

- Les fibres musculaires

- Les fibres conjonctives

- Les graisses neutres

- Les acides gras

- Les savons

- Le mucus

• Les résidus d'origine végétale

- L'amidon

- La cellulose

* Les cristaux

• Les cristaux d'oxalate de calcium

• Les cristaux de Charcot-Leyden

• Les cristaux d'origine médicamenteuse

* Les éléments figurées d'origine endogène ' Les hématies

• Les leucocytes

• Les cellules épithéliales

• Les éléments mycéliens Blastocystis hominis Levures Arthrospores et filaments mycéliens

• La flore bactérienne