LE FROTTIS SANGUIN

 

1 - Principe

Le frottis sanguin est un étalement d'une goutte de sang sur une lame de verre, colorée par le May Grûnwald Giemsa et lue au microscope optique. L'étude minutieuse du frottis est extrêmement utile au diagnostic cytologique de nombreuses maladies hématologiques et parasitaires.

2- Echantillons

Cette analyse est réalisée classiquement chez un sujet à Jeun; cette précaution n'est pas toujours nécessaire. Le prélèvement peut être effectué sur du sang capillaire ou sur du sang veineux recueilli sur EDTA (éthylène diamine tétra acétique). Dès que la prise de sang est terminée, il faut homogénéiser le prélèvement par des mouvements de retournement doux pour éviter l'apparition de caillot. Une agitation forte provoque l'hémolyse.

4- Réactifs

• Solutions tampon de Sôrensen pH = 7

- Solution A: KH2 PO4    9,1 g/1

- Solution B : Na2 HPO4  9,5 g/1

On mélange ces deux solutions dans les proportions suivantes:

- Solution A             38,9 ml

- Solution B             61,1 ml

L'utilisation d'une eau impure ou non tamponnée (eau de robinet) donnera des cellules dont la couleur et la morphologie risquent de poser des problèmes d'interprétation pour te biologiste.

• Solution de May Grûnwald

• Solution de Giemsa diluée à 10% dans de l'eau tamponnée pH= 7. Les solutions de May Grunwald et de Giemsa sont prêtes à l'emploi et se conservent bien dans des flacons bruns bien bouchés à l'abri de la lumière pendant plusieurs mois. La solution tampon se conserve 1 mois à +4°C.

5- Mode opératoire

5.1 préparation du frottis sanguin

On dépose une petite goutte de sang de deux millimètres de diamètre environ à un centimètre à l'une des extrémités d'une lame propre posée horizontalement sur un plan dur. Puis, on place le bord de la lame rodée ou de la lamelle sur la lame et on fait glisser celle-ci jusqu'à ce qu'elle entre au contact avec la goutte, en maintenant un angle de 45°. La goutte s'étale le long de l'arête par capillarité. Puis, on pousse dans un mouvement uniforme vers l'autre extrémité de la lame sans atteindre celle-ci. Le frottis ainsi réalisé est séché rapidement par agitation à l'air. Il ne faut pas oublier de noter l'identité du patient (N°) avec un crayon sur la tête du frottis,

Un frottis de qualité doit respecter les critères suivants :

• II doit posséder une tête, un corps et une queue en empreinte de pouce

• II ne doit être ni trop mince (pauvre en éléments), ni trop épais (éléments rétractés non identifiables) et régulier avec des bords parallèles à la lame mais distants d'eux avec une extrémité arrondie.

• 11 ne doit atteindre ni les bords, ni les extrémités de la lame (les éléments les plus volumineux seront perdus)

• II doit être correctement séché (sinon présence d'artefacts, hématies crénelées)

• II ne doit pas présenter de stries (étaleur mal rodé) ou des trous (lame mal dégraissée).

5.2 coloration du frottis

Première étape : fixation et coloration par le May Grûnwald

On trempe le frottis dans un bac contenant le May Grûnwald pur, préalablement filtré,

pendant 3 à 5 minutes.

Deuxième étape : rinçage à l'eau tamponnée pH = 7

On sort le frottis et on le trempe dans un bac contenant l'eau tamponnée pH = 7 pendant

2 à 3 minutes.

Troisième étape : coloration par le Giemsa dilué

On sort le frottis et on le trempe dans un bac contenant la solution de Giemsa, préalablement

filtrée et diluée au 1/10 dans l'eau tamponnée/ pendant 20 à 30 minutes.

Quatrième étape : rinçage à l'eau tamponnée pH = 7                           

On trempe le frottis dans un bac plein d'eau tamponnée pendant 2 à 3 minutes.

Cinquième étape : séchage à l'air libre                                            

Les lames colorées sont égouttées et séchées à l'air libre. Il faut attendre au moins 5 minutes avant de les lire. Au terme de ces étapes, le frottis sanguin est prêt à être étudié au microscope optique.

5.3 étude du frottis sanguin

Contrôle du frottis :

Pour déterminer la répartition des cellules, la qualité de l'étalement et de la coloration, il

faut tout d'abord contrôler le frottis aux grossissement (obj xl00). Si la répartition est jugée

Satisfaisante, on dépose une petite goutte d'huile à immersion sur la queue de l'étalement,

Puis on met en place l'objectif x100. La répartition des cellules n'est pas parfaitement égale. Les leucocytes doivent être intacts et leur répartition relativement homogène. Tout de même/ on ne peut éviter une certaine ségrégation. Les éléments les plus petits tels que les lymphocytes se regroupent au centre du frottis, les plus volumineux (polynucléaires et monocytes) sont entraînés dans les franges et la queue. Les hématies observées dans la zone d'épaisseur idéale, doivent être étalées en couche

monocellulaire; leurs contours doivent être réguliers et leur coloration rosé.

Au cours de la lecture du frottis/ le biologiste doit signaler la présence éventuelle de cellules

hémotopoïétiques jeunes appartenant à la lignée médullaire. De même, il doit informer

le clinicien de tout parasite observé sur le frottis.